1 白細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型(Animal model of leucopenia)

在研究化療藥物毒性的減毒實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常需要建立化療所致的白細(xì)胞減少癥及骨髓有核細(xì)胞減少癥的動(dòng)物模型。白細(xì)胞減少癥(leucopenia)為臨床常見血液病。凡機(jī)體外周血液中白細(xì)胞數(shù)持續(xù)低于4×1000000000/L時(shí)，稱之為白細(xì)胞減少癥；若機(jī)體白細(xì)胞總數(shù)明顯減少，低于2×1000000000/L，中性粒細(xì)胞值低于0.5×1000000000/L甚至消失者，則稱為粒細(xì)胞缺乏癥(agranulocysis)。臨床上白細(xì)胞減少癥患者的臨床表現(xiàn)主要為乏力、頭暈，并常伴有食欲減退、四肢酸軟、失眠多夢(mèng)、低熱心悸、畏寒腰酸等癥狀；而粒細(xì)胞缺乏癥則多以突然發(fā)病、畏寒高熱、咽痛為主。粒細(xì)胞缺乏癥為白細(xì)胞減少癥發(fā)展至嚴(yán)重階段的表現(xiàn)，兩者病因和發(fā)病機(jī)制基本相同。臨床上白細(xì)胞減少癥主要可分為原因不明性和繼發(fā)性兩種。其中又以前者多見，而后者則多為化學(xué)因素、物理因素、藥物因素及某些疾病；或可見于各種實(shí)體腫瘤化療后、多種血液疾病、嚴(yán)重感染及原因不明者等。

1.1 大鼠白細(xì)胞減少癥模型

(1)復(fù)制方法  體重約為150g的SD大鼠，按30mg/kg體重的劑量經(jīng)其腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射5d。模型大鼠在給藥前、給藥第3, 5日，以及停藥后第2, 5, 8, 11, 15日時(shí)分別采血作外周血象檢測(cè)，觀察外周血白細(xì)胞總數(shù)。后1次檢測(cè)觀察后麻醉處死動(dòng)物，取其股骨，用hanks液沖洗骨髓細(xì)胞，顯微鏡下觀察骨髓有核細(xì)胞數(shù)。

(2)模型特點(diǎn)  注射環(huán)磷酰胺后，模型大鼠的食耗量、飲水量減少，活動(dòng)減少，被毛疏松無光澤，體重增長(zhǎng)趨緩，明顯消瘦；停藥15d后機(jī)體開始明顯恢復(fù)。給藥3d時(shí)，模型大鼠的外周血白細(xì)胞總數(shù)明顯降低，給藥5d時(shí)其外周血白細(xì)胞總數(shù)可降至低值；停藥后第2日時(shí)白細(xì)胞總數(shù)無明顯回升，停藥第5, 8, 11, 15日時(shí)，白細(xì)胞總數(shù)呈逐漸回升趨勢(shì)；模型大鼠低白細(xì)胞水平維持時(shí)間較長(zhǎng)，至停藥后第15日時(shí)仍未見明顯回升。鏡下觀察顯示：模型大鼠的骨髓有核細(xì)胞數(shù)較正常動(dòng)物明顯降低。

(3)比較醫(yī)學(xué)  本模型通過對(duì)動(dòng)物機(jī)體白細(xì)胞總數(shù)、體重變化以及骨髓有核細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果的多點(diǎn)動(dòng)態(tài)分析，模型大鼠表現(xiàn)出低白細(xì)胞、低骨髓有核細(xì)胞及低體重的特點(diǎn)，與臨床上腫瘤患者的化療毒性一致，本模型可用于臨床化療毒性的防治、藥物篩選或其他防治方法方面的研究。以往這方面的研究均用小鼠建立模型，但由于小鼠外周血白細(xì)胞第6日以后即可超越基礎(chǔ)水平，往往造成實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間不夠，導(dǎo)致無法評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而本方法建立的模型，停藥后模型大鼠白細(xì)胞回升緩慢，至停藥后第15日時(shí)仍能維持低白細(xì)胞水平狀態(tài)，因此能夠滿足實(shí)驗(yàn)研究的觀察時(shí)間。

1.2 急性白血病動(dòng)物模型(Animal model of acute myelogenous leukemia)

臨床上急性白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是指機(jī)體內(nèi)一種或多種造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞惡變，失去正常的增殖、分化及成熟能力，無控制的持續(xù)增殖，逐步取代骨髓并經(jīng)丨血液浸潤(rùn)至全身組織及器官。

1.小鼠粒單白血病模型

(1)復(fù)制方法  體重約為20g，年齡為8周齡的 BALB/c雄性小鼠。用1000r/min離心急性粒單白血病細(xì)胞的培養(yǎng)液10min，去上清后用生理鹽水清洗3次，調(diào)整濃度至2×1000000000/L。經(jīng)小鼠尾靜脈注射已制備好的細(xì)胞懸液，0.5ml/只。接種后每天觀測(cè)模型小鼠的生存天數(shù)，采血作小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、未成熟粒單核細(xì)胞百分率及骨髓原始粒單核細(xì)胞百分率檢測(cè)，透射電鏡下觀察其骨髓白血病細(xì)胞形態(tài)。

(2)模型特點(diǎn)  采用尾靜脈途徑接種的方法，模型小鼠的生存時(shí)間可達(dá)到(38.40±2.21)d；其外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和未成熟粒單核細(xì)胞百分率在接種第14日時(shí)明顯升高，分別為(19.24±1.73)×1000000000/L和(6.24±0.85)％，并有逐漸上升的趨勢(shì)；其骨髓原始粒單核細(xì)胞百分率亦明顯升高，可達(dá)到(41.3±4.90)％。本模型制作方法簡(jiǎn)便，容易掌握，模型成功率高，重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)過程中，模型小鼠由于免疫力低下，因此需加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件的控制。

(3)比較醫(yī)學(xué)  臨床上急性粒單白血病以骨髓或外周血中同時(shí)出現(xiàn)原始髓系細(xì)胞分化而來的原幼粒系和單核系兩種幼稚細(xì)胞為主要特征。本模型的病理特點(diǎn)與臨床人類急性粒單白血病相似，適用于臨床同類疾病發(fā)病機(jī)理及藥物治療方面的研究。

1.3 慢性白血病動(dòng)物模型(Animal model of chronic myelogenous leukemia)

臨床上慢性白血病(chronic myelogenous leukemia,  CML)可分為慢性骨髓細(xì)胞性白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病兩種。慢性骨髓細(xì)胞性白血病，簡(jiǎn)稱慢粒(chronic myelognous leukemia, CML)，是臨床上一種起病及發(fā)展相對(duì)緩慢的白血病。它是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，表現(xiàn)為髓系祖細(xì)胞池?cái)U(kuò)展，髓細(xì)胞系及其祖細(xì)胞過度生長(zhǎng)。CML臨床上以乏力、消瘦、發(fā)熱、脾腫大及白細(xì)胞異常增高為主要表現(xiàn)。慢性淋巴細(xì)胞白血病，簡(jiǎn)稱慢淋(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL)，是機(jī)體的淋巴細(xì)胞在體內(nèi)異常增生和積蓄伴有免疫功能低下的疾病。由于慢淋患者淋巴細(xì)胞壽命極長(zhǎng)，并經(jīng)常伴有免疫反應(yīng)缺陷，故又稱免疫無能淋巴細(xì)胞蓄積病。臨床主要表現(xiàn)是以淋巴結(jié)腫大為主，常伴有肝脾腫大，貧血及出血等癥狀，少數(shù)患者還伴有皮膚損害。

1.免疫缺陷小鼠－人慢性粒白血病模型

(1)復(fù)制方法  NOD/D小鼠，系通過D小鼠與 NOD/Lt品系(TL、BL、NK細(xì)胞缺陷，循環(huán)補(bǔ)體缺乏，抗原呈遞細(xì)胞分化及功能不良)回交得到的NOD/Ltsz-scid/scid小鼠(簡(jiǎn)稱NOD-D小鼠)。先用400cGy 60Coγ射線照射小鼠，再?gòu)奈唇邮苓^化療的慢性期CML患者的新鮮骨髓和外周血中分離出白血病細(xì)胞，將(8～14)×10000000白血病細(xì)胞從尾靜脈輸入已經(jīng)過亞致死量射線照射的小鼠，并交替腹腔注射PIXY321(7μg)及c-kit配體(10μg)制劑。CML細(xì)胞移植后30～90d內(nèi)處死小鼠，用人bcr特異DNA探針進(jìn)行 Southern印跡分析和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

(2)模型特點(diǎn)  移植后的NOD/D小鼠體內(nèi)大約70％的人CML細(xì)胞為Ph-細(xì)胞。無論是用CML患者的骨髓細(xì)胞還是外周血細(xì)胞移植，ph+細(xì)胞檢測(cè)水平很相似。用本方法復(fù)制CML模型，NOD/D小鼠效果要優(yōu)于D小鼠。由于NOD/D小鼠體內(nèi)缺乏功能性NK細(xì)胞，采用較少數(shù)量的患者CML慢性期細(xì)胞就能成功建立模型。如將人造血干細(xì)胞或胎肝細(xì)胞移植到NOD/D小鼠體內(nèi)，則人髓系白細(xì)胞數(shù)明顯增加，人造血干細(xì)胞明顯向髓系方向分化，而紅系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞明顯減少；此時(shí)如采用患者 CML細(xì)胞，尤其是加速期和急變期細(xì)胞更容易移植成功。

(3)比較醫(yī)學(xué)  以往研究發(fā)現(xiàn)來源于CML患者急變期的瘤細(xì)胞能夠在SCD小鼠身上繁殖，白血病細(xì)胞在轉(zhuǎn)移到無造血功能組織之前主要分布在骨髓、外周血，與其在人體內(nèi)的分布相似。但由于小鼠的造血生長(zhǎng)因子、黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)與人并不相同，因此建立的免疫缺陷小鼠-人慢粒白血病模型仍存在局限性。但是采用NOD/ SCD小鼠仍可用于制備較為理想的人CML動(dòng)物模型。

2.用表達(dá)P210逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞并移植正常鼠

(1)復(fù)制方法  分離用氟尿嘧啶(5-Fu)(150mg/kg體重)預(yù)處理的雄性BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞，并以P210基因逆病毒載體轉(zhuǎn)染，按(1～2)×100000細(xì)胞注射到接受致死劑量照射的同源雌性小鼠體內(nèi)。潛伏期大于20周的小鼠表現(xiàn)出粒細(xì)胞異常增生，造血功能紊亂，從這些小鼠身上分離的細(xì)胞，可有效地移植到經(jīng)照射的同源小鼠體內(nèi)，表明轉(zhuǎn)染bcr/abl基因的鼠骨髓細(xì)胞具有高度再生能力，可用來模擬人CML。采用MSC逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可提高表達(dá)ber/abl融合基因的病毒滴度，CML潛伏期短，接受轉(zhuǎn)染細(xì)胞的小鼠經(jīng)過4～6周潛伏期后都可發(fā)生CML。主要變化有外周血白細(xì)胞顯著增多，脾臟腫大，bcr/abl融合蛋白表達(dá)。

(2)模型特點(diǎn)  發(fā)現(xiàn)無論abl基因的形式如何，均有90％小鼠發(fā)生腫瘤。在這些小鼠中有大約50％小鼠表現(xiàn)異常骨髓增殖，與人慢性粒細(xì)胞白血病慢性期的特征有許多相似之處，而其余的小鼠則表現(xiàn)為B淋巴細(xì)胞異常增生。

(3)比較醫(yī)學(xué)  采用本方法建立的CML動(dòng)物模型與臨床上人類CML尚有一些差異，如大多數(shù)CML模型鼠往往在短期內(nèi)迅速死亡，沒有經(jīng)歷類似于人CML的慢性期，而且模型動(dòng)物肺部出血現(xiàn)象很明顯，這在人類CML很少見。

3.bcr/abl轉(zhuǎn)基因小鼠模型

(1)復(fù)制方法  用小鼠的Tec基因的啟動(dòng)子序列(-1948至+22)作為調(diào)節(jié)序列，制備轉(zhuǎn)基因載體。Tec基因的啟動(dòng)子序列調(diào)控P210蛋白的表達(dá)，制備轉(zhuǎn)基因小鼠， bcr/abl融合蛋白的表達(dá)對(duì)小鼠的胚胎有致死性。

(2)模型特點(diǎn)  目前仍不能獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠及其子代均表現(xiàn)CML癥狀，一些個(gè)體可能表現(xiàn)出急性白血病癥狀。

(3)比較醫(yī)學(xué)  多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠先出現(xiàn)粒細(xì)胞異常增生、高血小板血癥，經(jīng)時(shí)間后發(fā)生骨髓增殖綜合征(MPD)，和人CML極為相似。少數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后即表現(xiàn)為急性白血病，但它們的子代經(jīng)過一段潛伏期后表現(xiàn)為骨髓增生綜合征。表明選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子對(duì)構(gòu)建CML轉(zhuǎn)基因鼠是十分重要的。