一、研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，常在慢性肝臟炎癥（如乙/丙型肝炎病毒感染、酒精濫用或非酒精性脂肪性肝炎）背景下發(fā)生發(fā)展。腫瘤微環(huán)境（TME）中富集著多種免疫細(xì)胞，其中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是調(diào)控腫瘤促進(jìn)性炎癥和免疫逃逸的關(guān)鍵角色。

中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）是由活化中性粒細(xì)胞釋放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由DNA、組蛋白和抗菌蛋白組成。除最初發(fā)現(xiàn)的捕獲病原體的功能外，NETs還可通過促進(jìn)轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和血管生成等方式參與癌癥進(jìn)展。已有研究表明，NETs攜帶多種損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），可差異性地調(diào)控腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞功能。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）具有顯著可塑性，可分化為促炎型M1和促腫瘤型M2巨噬細(xì)胞。M2巨噬細(xì)胞又可進(jìn)一步細(xì)分為M2a、M2b、M2c和M2d亞群，其中M2d亞群因高分泌IL-10、TGF-β和VEGF而備受關(guān)注，在腫瘤進(jìn)展、血管生成和免疫抑制中發(fā)揮重要作用。然而，中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在HCC微環(huán)境中的相互作用及其對(duì)疾病進(jìn)展的貢獻(xiàn)機(jī)制仍不清楚。本研究旨在闡明NETs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞重編程機(jī)制及其對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響，并探索中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間是否存在相互調(diào)控的反饋環(huán)路

我來詳細(xì)閱讀并解讀這篇關(guān)于中性粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞串?dāng)_通過NETs-IL-17/VEGF/S100A9軸促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的研究論文。

二、研究結(jié)果

2.1 NETs水平在HCC患者中升高，尤其在晚期和轉(zhuǎn)移階段

基于TCGA-LIHC隊(duì)列（368例腫瘤樣本和50例癌旁正常樣本）的生物信息學(xué)分析顯示，36個(gè)NETs相關(guān)基因中大多數(shù)在HCC組織中顯著上調(diào)。在臨床樣本驗(yàn)證中，HCC患者肝組織中的CD66b?中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和CitH3（瓜氨酸化組蛋白H3，NETs特異性標(biāo)志物）表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照（HC）。HCC患者外周血中性粒細(xì)胞中CitH3表達(dá)也明顯升高。血清MPO-DNA（循環(huán)NETs標(biāo)志物）水平在HCC患者中顯著升高，且與TNM分期呈正相關(guān)，IV期患者最高。值得注意的是，伴轉(zhuǎn)移的HCC患者M(jìn)PO-DNA水平更高，尤其是伴肝外轉(zhuǎn)移者。外周血中性粒細(xì)胞中CitH3在肝外轉(zhuǎn)移患者中也顯著升高。這些結(jié)果表明NETs水平與HCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2.2 HCC中M2巨噬細(xì)胞富集與NETs形成密切相關(guān)

TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，M2相關(guān)基因在HCC組織中普遍上調(diào)，而M1相關(guān)基因表達(dá)模式不一致。免疫熒光染色證實(shí)HCC腫瘤中CD68?CD206?M2巨噬細(xì)胞顯著增加。血清中M2d相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β、VEGF、IL-10和CCL13在HCC患者中顯著升高。進(jìn)一步的相關(guān)性分析揭示NETs相關(guān)基因與M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因呈正相關(guān)。HCC組織中NETs水平高的區(qū)域伴隨更多M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，且血清M2d細(xì)胞因子水平與MPO-DNA呈正相關(guān)。這些臨床數(shù)據(jù)提示中性粒細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞在HCC腫瘤微環(huán)境中存在潛在相互作用。

2.3 NETs在HCC細(xì)胞存在時(shí)促進(jìn)M2d巨噬細(xì)胞極化

體外實(shí)驗(yàn)首先證實(shí)NETs單獨(dú)刺激不能直接誘導(dǎo)THP-1來源或PBMC來源的M0巨噬細(xì)胞向M1（CD68?CD86?）或M2（CD68?CD206?）極化。為模擬腫瘤微環(huán)境，建立了多細(xì)胞共培養(yǎng)體系：將M0巨噬細(xì)胞與正常肝細(xì)胞（THLE-2）或HCC細(xì)胞（HuH-7）共培養(yǎng)，同時(shí)加入或不加入NETs。結(jié)果顯示，與HuH-7細(xì)胞單獨(dú)共培養(yǎng)可適度增加M2巨噬細(xì)胞比例；加入NETs后，M2極化顯著增強(qiáng)且呈時(shí)間依賴性。而與THLE-2共培養(yǎng)時(shí)NETs無(wú)此效應(yīng)。M2d相關(guān)基因（VEGF、IL-10、TGF-β）的mRNA水平及蛋白分泌在NETs+HuH-7組顯著上調(diào)，M1標(biāo)志物iNOS和TNF-α則無(wú)顯著變化。這些結(jié)果表明NETs需要在HCC細(xì)胞存在的環(huán)境下才能有效促進(jìn)M2d極化。

2.4 NETs攜帶的IL-17激活I(lǐng)L-17R/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化

為探究NETs調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，對(duì)三組THP-1-M0（單獨(dú)培養(yǎng)、與HuH-7共培養(yǎng)、與HuH-7+NETs共培養(yǎng)）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。KEGG分析顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組共同富集了14條關(guān)鍵信號(hào)通路，其中IL-17和TNF信號(hào)通路在NETs添加組（C vs B）中尤為突出。引入IL-17R抑制劑AMG827后，NETs誘導(dǎo)的M2極化顯著受抑，VEGF和IL-10表達(dá)下降。

進(jìn)一步鑒定IL-17來源發(fā)現(xiàn)：HCC患者來源的NETs中IL-17蛋白水平顯著高于健康對(duì)照，ELISA定量也證實(shí)NETs攜帶的IL-17在HCC患者中顯著升高。HCC患者中性粒細(xì)胞胞內(nèi)IL-17水平也顯著增高。免疫熒光顯示IL-17廣泛沉積在HCC患者NETs上。由于NF-κB是IL-17R激活的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子，實(shí)驗(yàn)證實(shí)NETs增加巨噬細(xì)胞中NF-κB p-p65水平，而AMG827可減弱此效應(yīng)。NF-κB抑制劑BAY11-7082同樣可抑制NETs誘導(dǎo)的M2極化和M2d細(xì)胞因子分泌。綜上，NETs通過攜帶的IL-17激活I(lǐng)L-17R/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)M2d極化。

2.5 NETs誘導(dǎo)的M2d巨噬細(xì)胞極化加劇HCC惡性進(jìn)展

為評(píng)估NETs介導(dǎo)的M2d對(duì)HCC惡性行為的影響，制備了四種條件培養(yǎng)基（CM）：CM(HuH-7/HepG2)、CM(HuH-7/HepG2+M0)、CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)和CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs+AMG827)。結(jié)果顯示，各組對(duì)HCC細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)顯著影響。但CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)顯著增強(qiáng)HUVEC管腔形成能力（血管生成），AMG 827可部分逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。

體內(nèi)皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)中，將Hepa1-6細(xì)胞與RAW264.7和NETs共注射可顯著增加腫瘤體積和重量，PCNA（增殖標(biāo)志物）、CD31和VEGF（血管生成標(biāo)志物）、CD206（M2標(biāo)志物）及CitH3表達(dá)均上調(diào)，而CD86（M1標(biāo)志物）無(wú)變化。AMG 827可部分逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)。在DEN/CCl4誘導(dǎo)的自發(fā)性HCC模型中，LPS誘導(dǎo)NETs形成可顯著促進(jìn)HCC進(jìn)展（增加腫瘤負(fù)荷、肝/體重比和腫瘤面積），DNase I（降解NETs）或AMG827均可部分逆轉(zhuǎn)。免疫組化/免疫熒光證實(shí)NETs誘導(dǎo)增加M2（F4/80?CD206?）積累及Ki67、CD31、VEGF上調(diào)。這些體內(nèi)外結(jié)果驗(yàn)證了IL-17信號(hào)在NETs誘導(dǎo)M2極化和促腫瘤功能中的關(guān)鍵作用。

2.6 NETs誘導(dǎo)M2d巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移

Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，CM(HuH-7/HepG2+M0+NETs)顯著增加HuH-7和HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力，AMG 827處理可部分減少。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，該條件培養(yǎng)基降低上皮標(biāo)志物E-cadherin、增加間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)，提示EMT過程被激活；同時(shí)侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9表達(dá)升高，AMG827可逆轉(zhuǎn)這些分子改變。

體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移模型中，尾靜脈注射Hepa1-6+RAW264.7+NETs組小鼠肺組織重量、轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)和轉(zhuǎn)移面積均顯著增加，AMG827可部分抑制。這些結(jié)果一致表明NETs介導(dǎo)的M2d極化可促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移。

2.7 M2d巨噬細(xì)胞來源的VEGF通過間接促進(jìn)HCC細(xì)胞來源的S100A9誘導(dǎo)NETs形成

為探究NETs誘導(dǎo)的M2d是否反過來調(diào)控NETs釋放，將中性粒細(xì)胞暴露于不同條件培養(yǎng)基。CM-M0對(duì)CitH3無(wú)顯著影響；CM-HuH-7可誘導(dǎo)CitH3上調(diào)；CM-(HuH-7+M0)進(jìn)一步增強(qiáng)；CM-(HuH-7+M0+NETs)達(dá)到高水平。免疫熒光檢測(cè)DNA/MPO/CitH3也證實(shí)相同趨勢(shì)，表明HCC細(xì)胞來源因子促進(jìn)NET形成，而與NETs誘導(dǎo)的M2d串?dāng)_具有更強(qiáng)的刺激效應(yīng)。

鑒于前期研究發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞釋放的S100A9促進(jìn)NET形成，本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CM-(HuH-7+M0+NETs)顯著上調(diào)HuH-7細(xì)胞S100A9表達(dá)，ELISA定量也證實(shí)培養(yǎng)上清中S100A9升高。加入S100A9抑制劑Paquinimod后，CM-(HuH-7+M0)和CM-(HuH-7+M0+NETs)誘導(dǎo)的CitH3均顯著下調(diào)，免疫熒光也證實(shí)NETs形成減少。進(jìn)一步探索M2d調(diào)控S100A9的機(jī)制：由于NF-κB驅(qū)動(dòng)S100A9表達(dá)，且M2d分泌大量VEGF可激活NF-κB，假設(shè)M2d通過VEGF-NF-κB軸誘導(dǎo)S100A9。VEGFR抑制劑AV-951處理顯著降低HuH-7細(xì)胞中p-p65(S536)和S100A9水平。外源性VEGF刺激增加S100A9和p-p65，而NF-κB抑制劑BAY11-7082可消除這些效應(yīng)。臨床樣本相關(guān)性分析顯示：NETs-IL-17與MPO-DNA正相關(guān)；VEGF與NETs-IL-17正相關(guān)；S100A9與VEGF正相關(guān)；S100A9與MPO-DNA正相關(guān)。這些相關(guān)性數(shù)據(jù)支持NETs-IL-17→VEGF→S100A9→NETs的正反饋環(huán)路存在。

2.8 中性粒細(xì)胞來源的NETs-IL-17在HCC患者中的臨床意義

按臨床病理參數(shù)分層分析NETs-IL-17分布：性別、年齡、腫瘤大小和數(shù)量對(duì)NETs-IL-17水平無(wú)顯著影響，提示該標(biāo)志物不受這些基線變量影響。TNM I+II期與III+IV期間無(wú)顯著差異（p=0.06），有無(wú)轉(zhuǎn)移間也無(wú)差異。但在伴轉(zhuǎn)移的病例中，肝外轉(zhuǎn)移者NETs-IL-17顯著高于無(wú)肝外轉(zhuǎn)移者（p=0.0001）。

ROC曲線分析顯示：區(qū)分早晚期HCC時(shí)，NETs、NETs-IL-17、VEGF和S100A9的AUC分別為0.61、0.65、0.51和0.54，判別能力有限。預(yù)測(cè)總體轉(zhuǎn)移狀態(tài)時(shí)AUC分別為0.64、0.57、0.51和0.53，表現(xiàn)同樣一般。但預(yù)測(cè)肝外轉(zhuǎn)移時(shí)，NETs和NETs-IL-17的AUC分別提升至0.80和0.89，顯著優(yōu)于VEGF（0.61）和S100A9（0.62）。在所有檢測(cè)標(biāo)志物中，NETs-IL-17對(duì)肝外轉(zhuǎn)移的識(shí)別能力強(qiáng)，顯示出作為預(yù)測(cè)HCC肝外轉(zhuǎn)移的非侵入性生物標(biāo)志物的潛力。

三、研究結(jié)論

本研究揭示了HCC腫瘤微環(huán)境中中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間通過NETs-IL-17/VEGF/S100A9軸建立的正反饋環(huán)路，具體機(jī)制如下：

? NETs→M2d極化：HCC微環(huán)境中，中性粒細(xì)胞釋放的NETs攜帶IL-17，通過激活巨噬細(xì)胞表面IL-17R及其下游NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促腫瘤的M2d表型極化。此過程需要HCC細(xì)胞的存在，NETs單獨(dú)不能直接誘導(dǎo)極化。

? M2d→NETs形成：極化的M2d巨噬細(xì)胞分泌VEGF，通過VEGFR激活HCC細(xì)胞中NF-κB信號(hào)，上調(diào)S100A9表達(dá)。S100A9作為DAMP進(jìn)一步刺激中性粒細(xì)胞釋放更多NETs，完成正反饋循環(huán)。

? 促腫瘤效應(yīng)：該正反饋環(huán)路加速HCC生長(zhǎng)（促進(jìn)血管生成）、侵襲和轉(zhuǎn)移（誘導(dǎo)EMT、上調(diào)MMP2/9）。

? 臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值：NETs-IL-17在預(yù)測(cè)HCC肝外轉(zhuǎn)移方面具有優(yōu)異的診斷效能（AUC=0.89），優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)志物，可作為無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物用于高風(fēng)險(xiǎn)患者的早期識(shí)別。同時(shí)，該軸的多個(gè)節(jié)點(diǎn)（NETs形成、IL-17R、VEGF、S100A9）均為可藥物干預(yù)的靶點(diǎn)，為HCC的聯(lián)合治療策略提供了新思路。