transwell實驗

transwell實驗服務原理

Transwell實驗利用帶有微孔膜（通常為聚碳酸酯材質(zhì)）的小室裝置，分隔上下兩層培養(yǎng)液，通過化學趨化因子（如血清、生長因子）誘導細胞遷移或侵襲：

• 遷移實驗：細胞直接穿過孔徑（通常5-8μm）到達下室，無需基質(zhì)膠，反映基礎(chǔ)遷移能力。

• 侵襲實驗：需預先在膜上涂覆Matrigel基質(zhì)膠（模擬細胞外基質(zhì)），細胞需分泌蛋白酶（如MMPs）降解膠層后才能穿透，模擬體內(nèi)侵襲過程。
  

實驗步驟

1. 基質(zhì)膠包被（僅侵襲實驗）：

• 稀釋Matrigel（常用1:8比例），取200μL加入上室，37℃孵育30分鐘形成凝膠層。

• 部分實驗直接使用未稀釋膠（150μL），凝固時間延長至5小時。

2. 細胞準備與接種：

• 消化細胞并計數(shù)，調(diào)整密度（如5×10?個/孔），用無血清培養(yǎng)基重懸后接種至上室。

• 下室加入含趨化因子（如20-30% FBS）的培養(yǎng)基，形成濃度梯度誘導遷移。

3. 培養(yǎng)與固定：

• 孵育時間依細胞類型而定（通常24-48小時），隨后取出小室，PBS清洗，甲醇固定細胞（10-30分鐘）。

4. 染色與計數(shù)：

• 使用結(jié)晶紫（0.4%-0.5%）染色5-20分鐘，棉簽擦除未遷移細胞，顯微鏡下計數(shù)下室或膜底面的細胞數(shù)。

transwell實驗服務應用領(lǐng)域

• 腫瘤研究：評估癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能（如檢測E2F1、LKB1基因沉默對舌鱗癌、肺癌細胞侵襲的影響）。

• 藥物篩選：測試化合物對細胞遷移/侵襲的抑制效果，如miR-325-3p通過靶向PBOV1抑制肝癌細胞轉(zhuǎn)移。

• 免疫與發(fā)育生物學：研究白細胞趨化、干細胞定向遷移等。

注意事項

1. 避免氣泡：接種時需輕柔，避免氣泡阻隔細胞遷移路徑。

2. 膜孔徑選擇：依細胞大小調(diào)整（8μm適用于腫瘤細胞，5μm用于較小細胞如白細胞）。

3. 血清梯度控制：下室需高濃度血清（≥20%），上室用無血清培養(yǎng)基，確保趨化效果。

4. 基質(zhì)膠處理：稀釋比例和凝固時間需優(yōu)化，過厚可能阻礙細胞穿透。

5. 細胞狀態(tài)：確保細胞活性＞90%，密度適中（過高易堆積，過低統(tǒng)計誤差大）。

結(jié)果分析

• 定量方法：直接計數(shù)（顯微鏡）、結(jié)晶紫溶解后測OD值，或MTT法。

• 統(tǒng)計學處理：需重復≥3次，采用t檢驗或ANOVA分析組間差異（如P<0.05為顯著）。

局限性及改進

• 傳統(tǒng)方法可能受外泌體或間隙連接干擾，改進方案可排除此類因素（如肝素阻斷外泌體攝?。?span>。