階段1：實驗設(shè)計與準(zhǔn)備
目標(biāo)設(shè)定：明確研究目的（疾病建模、藥物篩選、機制研究、細(xì)胞治療前探索）。
體細(xì)胞選擇：根據(jù)易獲取性、增殖能力、遺傳背景、表觀遺傳狀態(tài)選擇（常用：皮膚成纖維細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞、尿液上皮細(xì)胞）。
重編程因子選擇：
經(jīng)典Yamanaka因子：OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC （OSKM）。
其他組合：OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 等。
重編程方法選擇（關(guān)鍵決策點，見第二部分詳述）。
階段2：體細(xì)胞培養(yǎng)與準(zhǔn)備
階段3：重編程誘導(dǎo)
階段4：iPSC克隆的識別、挑取與擴增
識別：約2-4周后，出現(xiàn)類似人胚胎干細(xì)胞的、邊界清晰、核質(zhì)比高的克隆。
挑取：在顯微鏡下用槍頭或克隆環(huán)機械挑取單個克隆。
擴增：將克隆打散成小團塊，傳代至新的培養(yǎng)板中，逐步擴大培養(yǎng)。
階段5：iPSC系的鑒定與建系
這是驗證實驗成功與否的核心，需多維度驗證：
形態(tài)學(xué)：典型的ESC樣克隆形態(tài)。
多能性標(biāo)志物表達：
免疫熒光/流式細(xì)胞術(shù)：檢測OCT4, SOX2, NANOG, SSEA-3/4, TRA-1-60/81等蛋白表達。
qRT-PCR：檢測內(nèi)源性多能性基因的mRNA表達水平。
表觀遺傳狀態(tài)：檢測多能性基因啟動子區(qū)（如OCT4, NANOG）去甲基化狀態(tài)。
分化潛能（功能驗證準(zhǔn)）：
核型分析：確保在重編程和擴增過程中未發(fā)生染色體異常。
STR指紋鑒定：驗證iPSC與來源體細(xì)胞的遺傳一致性，排除交叉污染。
階段6：iPSC的維持、保藏與后續(xù)分化
維持培養(yǎng)：在無滋養(yǎng)層條件下，使用確定成分的培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。
冷凍保藏：建立主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫。
定向分化：根據(jù)研究目標(biāo)，將iPSC分化為特定細(xì)胞類型（如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞）。
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